宋杰课题组｜环状单链DNA在肿瘤疫苗与免疫治疗中的新进展
背景介绍围绕环状单链DNA（circular single-stranded DNA, Css DNA）这一分子生物学新工具，中国科学院杭州医学研究所宋杰课题组先前在Nature Communications及Science Advances上发表三篇文章分别从无细胞体系（Nature Communications 2024,15, 4635）和细胞体系（Nature Communications 2023,14,6665；Science Advances. 2025, 11,eadv3396）阐述环状单链 DNA 的蛋白表达机制及调控思路。传统核酸药物载体在基因治疗各有局限，常见的质粒DNA（pDNA）因含有细菌骨架序列和未甲基化CpG基序，易被先天免疫系统识别清除，引发炎症反应。mRNA载体虽免疫原性较低，但半衰期短，难以维持长效治疗。针对需要长效蛋白补充的疾病以及肿瘤治疗性疫苗的治疗需求，理想的基因表达载体应当同时具备低免疫原性与长效表达的特点，以克服现有技术的局限。近年来，Css DNA作为一种新型基因表达载体进入研究者视野。Css DNA的单链结构去除了冗余序列，可有效避免激活cGAS-STING通路，从而减少先天免疫识别。近期，宋杰课题组在Molecular Therapy、Advanced Healthcare Materials和Journal of Nanobiotechnology上连续发表三篇文章，在动物体系发现了Css DNA低免疫原性和长效表达的特点。文章进一步阐述了Css DNA用于肿瘤疫苗及免疫治疗的潜能，为下一代肿瘤疫苗和免疫治疗提供了全新的载体平台。研究内容一. “天然”低免疫原性首先，研究团队系统比较了Css DNA与pDNA的免疫原性差异。将EGFP编码的Css DNA与pDNA分别包封于脂质纳米颗粒（LNP）中，经静脉注射至小鼠体内。结果显示，pDNA-LNP组小鼠血清中IL-6、IFN-γ、IFN-β等炎症因子水平急剧升高，提示其激活了强烈的先天免疫反应；而Css DNA-LNP组上述炎症因子仅微弱上升，与空载LNP对照组无显著差异。进一步分析发现，Css DNA处理组小鼠血清中IL-1受体拮抗剂（IL-1RA）特异性上调，提示机体可能启动了负反馈机制以抑制残余炎症。在高剂量毒性实验中，pDNA-LNP组小鼠死亡率达40%，并出现严重肝损伤；而Css DNA-LNP组无死亡，仅见轻微转氨酶升高，组织病理学检查未见明显炎性浸润。机制研究表明，单链结构的Css DNA无法有效结合cGAS且去除了冗余序列，这是其低免疫原性的分子基础。图1. Css DNA与pDNA的免疫原性比较二. 长效稳定表达此外，采用体内电转染技术，将携带荧光素酶报告基因的Css DNA（Css Luc）和传统质粒DNA（pDNA）分别导入小鼠肌肉组织。活体成像结果显示，pDNA组的荧光信号在28天后明显衰减，而Css DNA组至少在315天内维持了稳定表达，表达强度比pDNA组高出近10倍。这种长效稳定表达的机制可能有两方面原因：一是Css DNA不含细菌骨架，避免了异染色质介导的基因沉默；二是其单链结构不易被cGAS-STING通路识别，减少了在细胞内的清除，从而延长了半衰期。图2. Css DNA与pDNA在小鼠肌肉中的长效表达比较三. 基于Css DNA的肿瘤疫苗及免疫治疗为评估Css DNA在肿瘤疫苗的应用潜力，研究团队选用卵清蛋白（OVA）作为模式抗原，构建了Css OVA疫苗，并在B16-OVA黑色素瘤和E.G7-OVA淋巴瘤模型中验证其预防与治疗效果。单次接种90天后，Css OVA组仍有5/8小鼠未成瘤，而pDNA对照组小鼠全部发生肿瘤。进一步将Css OVA与Css IL-12联合用于治疗性疫苗接种，结果显示，联合治疗组小鼠肿瘤生长显著减缓，中位生存期延长2倍以上。图3. Css OVA肿瘤疫苗的长期预防此外，在c-MYC/p53原发性肝癌模型中验证Css IL-12-LNP治疗效果。静脉注射Css IL-12-LNP后，肿瘤组织中检测到IL-12高表达，CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T细胞浸润显著增加，肿瘤重量较对照组减轻70%以上。安全性评估显示，Css DNA组非肿瘤肝组织仅出现轻微炎症反应，而pDNA组则观察到明显的肝细胞损伤和炎性浸润，再次验证Css DNA的安全性优势。图4. Css IL-12-LNP在原发性肝癌模型中的疗效研究团队进一步探索了瘤内注射作为递送途径的可行性。在Hepa1-6小鼠肝癌皮下模型及4T1三阴性乳腺癌模型中，Css IL-12 LNP瘤内注射展现出显著治疗效果。Css IL-12 LNP组肿瘤生长受到明显抑制，部分小鼠实现肿瘤完全消退，而空载LNP对照组小鼠全部死亡。相比之下，质粒IL-12 LNP组虽也有完全缓解的个例，但肿瘤抑制速度和生存获益均略逊于Css组。在此基础上，研究团队尝试通过叶酸修饰构建靶向LNP（FA-LNP），以实现静脉注射后的主动递送。结果显示，FA-IL-12-LNP治疗组的肿瘤抑制效果显著优于非靶向对照组。图5. 瘤内注射与主动靶向Css IL-12 LNP的疗效总结与展望宋杰课题组围绕Css DNA开展的三篇动物体内研究，系统验证了Css DNA作为新型基因载体的核心优势：(1) 低免疫原性。Css DNA的单链结构可规避cGAS-STING通路的识别，加之不含冗余序列，显著降低了炎症反应，安全性优于传统pDNA。(2) 长效稳定表达。单次给药可在体内维持稳定表达至少300天，效果远超mRNA与pDNA，尤其适用于需长期补充蛋白的疾病治疗。(3) 广泛的肿瘤适应性。在肝癌、三阴性乳腺癌、黑色素瘤及淋巴瘤等多种模型中均验证了其治疗潜力，既可构建治疗性疫苗，亦可作为免疫增敏剂联合应用。(4) 灵活的给药方式。支持瘤内注射与静脉注射，适配不同临床需求。。未来Css DNA平台可进一步拓展至蛋白替代疗法、罕见病基因治疗等领域。其程序化设计和易于规模化生产的特性，使其具备良好的临床转化前景。参考文献Zhang Y, Cao X, Hu G, et al. Targeted Delivery of Circular Single-Stranded DNA Encoding IL-12 for the Treatment of Triple-Negative Breast Cancer. Advanced Healthcare Materials. 2024;13(29):2401376.Liu R, Ye R, Hu G, et al. Antigen-encoding circular single-stranded DNA for cancer vaccine. Molecular Therapy. 2026; In press.Hu G, Ye R, Li Z, et al. Interleukin-12 expressing circular single-stranded DNA lipid nanoparticles reprograms the immunosuppressive tumor microenvironment of hepatocellular carcinoma. Journal of Nanobiotechnology. 2026.
2026-03-06
